Instalaciones e Instrumentación

Los instrumentos están a disposición de cuantos investigadores los demanden. En caso contrario, se indica la fecha probable de su puesta en marcha para usuarios.

1. Analizadores automáticos de secuencias y fragmentos de ADN

Descripción: un Analizador de 4 capilares, modelo ABI Prism 3130 de Applied Biosystems ( foto  ), y dos Analizadores de capilar único del tipo ABI Prism 310, Applied Biosystems ( foto  ).

Programas de análisis disponibles para usuarios:

  • SeqScape v 2.5.
  • GeneMapper v 3.7.

Para la secuenciación de ADN ( foto  ), las condiciones que han de cumplir el ADN molde a secuenciar y los cebadores están detalladas en nuestra hoja de registro . El laboratorio dispone de cebadores  a disposición de los usuarios .

Para los análisis de fragmentos de ADN, nuestro ABI Prism 3130 permite actualmente trabajar con las combinaciones de fluoróforos que se indican en el siguiente esquema:

Matrix Standard Dye Set Blue Green Yellow Red Orange
DS-33 G5 6FAM VIC NED PET LIZ (estándar de tamaño)
DS-30 D 6FAM HEX NED ROX (estándar de tamaño)
DS-32 F 5FAM JOE NED ROX (estándar de tamaño)
PowerPlex, 3100/3130 de Promega F FL JOE TMR CXR (estándar de tamaño)

Se podría calibrar el equipo para otras combinaciones si los usuarios así lo requiriesen.

En el caso de los análisis de fragmentos, se recomienda el siguiente esquema de partida en la preparación de las muestras:

  • 1 µl del producto de PCR con los fragmentos amplificados y marcados.
  • 0,5 µl del estándar de tamaño correspondiente.
  • 15 µl de formamida

Puede ser necesaria la optimización de este esquema. Por favor contacten con el personal del servicio, para obtener información adicional y recomendaciones más detalladas sobre los análisis de fragmentos de ADN.

Aplicaciones: secuenciación de ADN, detección de mutaciones, genotipado basado en el estudio de microsatélites (microsatellite genotyping) o en la identificación de mutaciones puntuales (single nucleotide polymorphism genotyping), análisis del polimorfismo de fragmentos amplificados de restricción (AFLP), etc.

2. Equipos de PCR a tiempo real

Descripción: 7500 y 7500 Fast Real Time PCR System de Applied Biosystems ( foto ). Se trata de dos equipos diseñados para trabajar en placa de 96 pocillos.

En el servicio se dispone de SYBR Green, y del material y espacio necesarios para que los usuarios lleven a cabo los distintos pasos de los ensayos de PCR a tiempo real.

Programas disponibles para usuarios:

  • 7500 Software v 2.0.6 : para recogida y análisis de datos.
  • Primer Express v 3.0: para diseño de sondas TaqMan y cebadores.
  • High Resolution Melting Software v 2.0.1.

Aplicaciones:

  • Cuantificación de ácidos nucleicos.
  • Estudio de la expresión de los genes.
  • Discriminación alélica o detección de variantes genéticas que afecten a un único nucleótido (single nucleotide polymorphism, SNP).
  • Establecimiento de la presencia o ausencia de secuencias de ácidos nucleicos específicas y de particular interés (Plus/Minus Assays).
  • High Resolution Melting Analysis (HRM; icon_pdf_sm). Sólo en el equipo 7500 Fast.

3. Plataformas Integradas para la hibridación y análisis de microarrays de ADN

Descripción: dos plataformas integradas, GeneChip Instrument System con Autoloader () y GeneAtlas Microarray System () de Affymetrix.

GeneChip Instrument System con Autoloader trabaja con arrays de cartucho (GeneChip Arrays) fabricados mediante fotolitografía y, junto con el software Affymetrix GeneChip Command Console (AGCC), incluye los siguientes componentes: Escáner GeneChip 30007G, Horno de hibridación mod.645, Estación de fluidos mod.450 y Autocargador de arrays.

GeneAtlas Microarray System procesa tiras de arrays (Arrays Strips) para estudios de expresión. Cada tira consta de 4 arrays fabricados mediante fotolitografía y, además del software GeneAtlas Instrument Control, la plataforma incluye 3 módulos: estaciones de hibridación, fluidos e imagen.

Aplicaciones puestas a punto (): análisis de expresión de genes.

En la plataforma GeneChip Instrument System con Autoloader se pueden llevar a cabo análisis de expresión a nivel de genes, de exones, investigación de procesos de splicing y análisis de microARN. Actualmente  se ofertan 40 arrays, que incluyen los genomas de 29 organismos modelo en diferentes versiones (3´ivt, gene o exon array), y sondas  originales de 153 organismos distintos por array en el caso de microARN.

En la plataforma GeneAtlas Microarray System se pueden realizar estudios de expresión de genes. Se procesan simultáneamente 4 arrays de un mismo organismo modelo; y en el formato requerido por la plataforma (Arrays Strips) se encuentran actualmente disponibles los genomas de 23 organismos distintos, algunos de ellos simultáneamente en versión 3´ivt y whole-transcript.

El procedimiento a seguir para realizar los análisis de expresión génica en cualquiera de las plataformas, así como los requerimientos del material genético de partida, se encuentran especificados en la guía del usuario . Las muestras deben ir acompañadas de la hoja de registro  cumplimentada.

Otras aplicaciones que potencialmente se podrían ofertar ():

-Genotipado de SNPs (single nucleotide polymorphisms); variaciones en el número de copias (CNV) y pérdida de heterocigosidad (LOH).
-Análisis de citogenética.
-Estudios de asociación a nivel de genomas completos (WGAS).
-Análisis de re-secuenciación.
-Estudios de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos a nivel de todo el transcriptoma, Chip-on-Chip y a nivel de promotores.
-Estudios de metilación.
-Estudios de absorción y metabolización de drogas.

4. Sistema bioanalizador

Descripción: sistema electroforético capilar 2100 Bioanalyzer de Agilent Technologies ( foto ).

Aplicaciones: permite determinar la cantidad, calidad y tamaño de ADN, ARN y proteínas. Combina la rapidez en la separación electroforética y en el análisis de los datos, con una reproducibilidad, resolución y sensibilidad muy elevadas.

En el servicio se dispone de los siguientes chips comerciales:

Nombre del chip Sensibilidad* Rango de tamaño analizable Resolución
Agilent DNA 1000 0,1-50 ng/µl 25-1000 bp 10% bp
Agilent DNA 7500 0,1-50 ng/µl 100-7500 bp 10% bp
Agilent RNA 6000 Pico 50-5000 pg/µl
Agilent Protein 200 Plus 15-2000 ng/µl 14-200 kDa 10% kDa
Agilent Protein 80 6-4000 ng/µl 5-80 kDa 10% kDa

* Para ADN y ARN, es suficiente con 1 µl por análisis de las concentraciones indicadas. En el caso de las proteínas, son necesarios 4 µl por análisis.

5. Equipo integrado de proteómica

Descripción: el equipo incluye los siguientes componentes:

  • Incubador para digestiones trípticas modelo Cool Block ALB 6400 de Fine PCR Co. Permite trabajar en el rango de temperaturas de 5 – 95 ºC.
  • Sistema para electroforesis uni y bidimensional de BioRad Laboratories que consta de Protean IEF Cell (para isoelectroenfoque en tiras de 7, 11 o 17 cm), Mini Protean Tetra Cell (cubeta y equipo de electroforesis para 1-4 geles de unos 8,6 x 6,8 cm) y Protean II XL Multi Cell (electroforesis para 1-6 geles de aproximadamente 16 x 16 cm o 18,3 x 19,3 cm).
  • Cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) modelo 1200 Series de Agilent Technologies, con sistema de bombeo cuaternario, inyector automático termostatizado para 100 muestras, compartimento termostatizado para las columnas de separación y detector múltiple de absorbancia de la clase MWD. Este equipo tiene la posibilidad de conexión a un espectrómetro de masas tipo MSD TOF de Agilent Technologies a través de una fuente de ionización tipo Electrospray (ESI).
  • Cromatógrafo líquido HPLC modelo 1100 Series de Agilent Technologies( foto ), con accesorio para cromatografía capilar, inyector automático termostatizado, detector tipo DAD y compartimento termostatizado para las columnas. Este equipo tiene la posibilidad de conexión al espectrómetro de masas Trap XCT Plus de Agilent Technologies a través de la fuente ESI.
  • Espectrómetro de masas tipo TOF modelo MSD TOF, Agilent Technologies ( foto ).
  • Espectrómetro de masas tipo trampa de iones modelo Trap XCT Plus de Agilent Technologies ( foto ).
  • Fuentes de ionización tipo ESI y AP-MALDI de Agilent Technologies, intercambiables entre los dos espectrómetros de masas.
  • Ordenador-Servidor modelo ProLiant ML330 de HP, con software Spectrum Mill de Agilent Technologies para la búsqueda e identificación de proteínas a partir de los espectros de masas de los digeridos trípticos.

Aplicaciones: identificación de moléculas, especialmente proteínas, a partir de mezclas complejas o proteomas. Están disponibles los siguientes análisis:

  • Análisis de muestras mediante MALDI-TOF. Utilizando la matriz adecuada se puede analizar la muestra sobre la fuente MALDI, para identificar sus componentes por espectrometría de masas con una precisión cercana a 3 ppm (centésima de unidad m/z) gracias a la alta resolución del TOF.
  • Identificación de proteínas mediante huella peptídica. La muestra que contiene una proteína desconocida se somete a digestión tríptica y se analiza en el MALDI-TOF, produciendo lo que se conoce como “huella peptídica”. Este resultado se puede comparar con bases de datos para identificar la proteína presente en la muestra.
  • Separación HPLC/ESI-MS. Las muestras complejas se pueden analizar con mayor facilidad acoplando la separación en alguna de las columnas disponibles de HPLC con la ionización tipo ESI, previamente a su introducción en el espectrómetro de masas.
  • Inyección directa ESI-Trap MS. Se pueden realizar un análisis rápido de muestras para su identificación por inyección directa sobre el espectrómetro de masas acoplado a la fuente ESI. Teóricamente, la trampa de iones permite obtener espectros de masa hasta MS11.
  • Identificación de proteínas mediante el análisis de los fragmentos digeridos por HPLC/ESI-Trap. La muestra que contiene una proteína desconocida se somete a digestión tríptica y se separa por HPLC, para posteriormente analizarla en la trampa de iones mediante el acoplamiento con la fuente ESI. Los espectros de masas MS y MS/MS sirven para identificar las proteínas presentes mediante su comparación con bases de datos.
  • Determinación de la masa molecular de proteínas y grandes biomoléculas mediante HPLC acoplada a espectrometría de masas. El procedimiento se basa en la separación previa de la muestra en una columna de HPLC específica para biomoléculas de gran tamaño; el acoplamiento de dicha columna a un espectrómetro de masas tipo ESI-Trap permite finalmente el cálculo preciso de la masa molecular por deconvolución matemática de los datos obtenidos.

6. Espectrómetro para medidas de absorbancia, dicroísmo circular (DC) y fluorescencia

Descripción: Espectrómetro p*-180 de Applied Photophysics ( foto ), acoplado a una unidad de cinética en estado de transición (Stopped-flow kinetic sample handling unit) o a una unidad para medidas en equilibrio (Equilibrium sample handling unit). Dispone de un accesorio para el control exacto de la temperatura (Peltier Temperature Controller).

Cubetas de cuarzo de que se disponen:

  • De 10 mm de paso de luz (Hellma 110 QS), para absorbancia y verificada para DC.
  • De 1 mm de paso de luz (Hellma 110 QS), verificada para DC.
  • De 10×10 mm (Hellma 111 QS) para fluorescencia.
  • Ultra-Micro de 10 x 2 mm de paso de luz (Hellma 105.250-QS), para medir fluorescencia con pequeños volúmenes de muestra (mínimo volumen requerido 125 µl).
  • En la unidad de stopped-flow el paso de luz de la cubeta es ajustable a 10 o 2 mm según precisen las distintas aplicaciones.

Las emisiones de fluorescencia se pueden medir mediante un monocromador acoplado al instrumento (SK.2E Scanning Emission Monochromator de Applied Photophysics), o recurriendo al empleo de filtros (high-pass or cut-off filters); actualmente se dispone de los filtros de 302, 320 y 475 nm.

Aplicaciones: en el caso de macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos, estudios conformacionales, de desnaturalización-renaturalización y de unión de ligandos. Análisis de la estructura secundaria y terciaria de las proteínas, ensayos enzimáticos en estado de transición o estacionario, etc.

7. Microcalorímetros

Descripción:

  • Microcalorímetro VP-ITC, MicroCal ( foto ).
  • Microcalorímetro VP-DSC, MicroCal ( foto ).(permite realizar barridos de temperatura en el rango comprendido entre –30 y 90 ºC).

Aplicaciones:

La calorimetría isotérmica de titulación (ITC) sirve para analizar la termodinámica de la unión entre dos moléculas en disolución (o más específicamente entre una macromolécula y su ligando). De hecho, es la única técnica que permite el cálculo de la constante de afinidad (Ka), de la variación de entalpía (ΔH) y del número de sitios de unión (n) directamente en un único experimento; la variación de energía libre (ΔG) y de entropía (ΔS) pueden entonces calcularse a partir de los datos experimentales. El resultado es la completa caracterización termodinámica de la unión. No es necesario marcar las moléculas que participan en la unión, pero la técnica requiere un alto grado de pureza de las mismas.

Mediante la calorimetría diferencial de barrido de alta sensibilidad (DSC) es posible detectar la presencia de una transición entre fases o estados diferentes de una muestra. Por ejemplo, permite determinar la temperatura de desnaturalización térmica de una proteína, la temperatura de transición entre distintas fases en mezclas lipídicas o la temperatura de desdoblamiento de la doble cadena de ADN. Además de establecer estas temperaturas, calcula la entalpía asociada al proceso.

8. Sistema en flujo continuo para la detección y el análisis cinético de interacciones moleculares por Surface Plasmon Resonance

Descripción: modelo BIACORE X ( foto ). El estudio de las interacciones moleculares –basado en la técnica conocida como Resonancia de Plasmones de Superficie (SPR)- se realiza en un sensor chip cuya superficie combina una alta capacidad de unión, reproducibilidad en las medidas y resistencia química. Una de las moléculas que interacciona se fija al chip, y la otra se hace pasar a flujo continuo sobre la superficie del mismo, recogiéndose un perfil de la unión o sensograma a tiempo real a partir del cual es posible inferir los parámetros que caracterizan la unión.

Aplicaciones: caracterización de las interacciones moleculares tanto en lo referente a su especificidad, velocidad (cálculo de las constantes cinéticas de las reacciones de asociación y disociación) y afinidad (cálculo de las constantes de equilibrio), como a la medida de la concentración de las especies implicadas. La caracterización de las uniones no requiere el marcaje de las moléculas que interactúan. Además, el diseño de los chips empleados permite para determinadas aplicaciones realizar las medidas partiendo de muestras muy poco purificadas e incluso de extractos crudos.

9. Sistema de microdisección por láser

Descripción: Leica AS LMD, Laser Microdissection System ( foto ). Equipo integrado que consta de un láser ultravioleta y un microscopio (objetivos de 4X, 10X, 40X, 63X y 100X). El sistema tiene instalados los accesorios que permiten trabajar con muestras fluorescentes.

Aplicaciones: aislamiento preciso y libre de contaminación de áreas o estructuras de interés a partir de preparaciones de tejidos o células. El aislamiento se realiza de acuerdo a criterios morfológicos.

10. Equipo de difracción de rayos X de ángulo pequeño y grande

Descripción ( foto ):

  • Generador de rayos X del tipo PW 3830 de Philips.
  • Cámara de difracción tipo Kratky, modelo HMB-GRAZ de HECUS X-RAY SYSTEMS GMBH, con compartimento termostatizado para muestras (de 5 a 60 ºC).
  • Detectores de ángulo pequeño (small angle) y ángulo grande (wide angle), para s=0,0075-0,07 y 0,20-0,29 Å-1, respectivamente (s = 2 senϑ/λ, siendo 2ϑ el ángulo de difracción y λ=1,54 Å).

Aplicaciones: determinación de la estructura y fase de mezclas lipídicas. Comparando los picos de refracción de Bragg con los valores teóricos se puede estimar la organización en que se encuentra la mezcla lípidica, así como el grosor de la misma. Determinación de la forma y tamaño global de proteínas. Los espectros de difracción se analizan mediante diferentes programas informáticos de simulación, que permiten estimar parámetros de la forma y tamaño global de la proteína como el radio de giro y el tamaño máximo de partícula.

11. Analizador de tamaño de partículas mediante dispersión por láser

Descripción: Espectrómetro AutoSizer 4800, Malvern Instruments ( foto ).

Aplicaciones: actualmente, sólo está puesto a punto el protocolo que permite medir el tamaño de partícula.

Fecha de puesta en marcha para usuarios del resto de las aplicaciones (determinación de masa moleculares y radios de giro): sin determinar.

12. Ultracentrífuga preparativa.

Descripción: modelo Optima L-100 XP de Beckman Coulter ( foto ).

Rotores disponibles: de ángulo fijo, 100 Ti () y 70 Ti (); y basculante, SW 41 Ti ().

Aplicaciones: separación de biopolímeros y orgánulos subcelulares.

13. Ultracentrífuga analítica.

Descripción: modelo ProteomeLabTM XL-I de Beckman Coulter ( foto ), con sistemas ópticos incorporados para medidas de absorbancia e interferencia.

Aplicaciones: experimentos de velocidad y equilibrio de sedimentación, para la determinación de parámetros moleculares y para juzgar el grado de pureza de proteínas y otras macromoléculas en disolución. Es posible el cálculo de coeficientes de sedimentación, masas moleculares, densidades de flotación y coeficientes de difusión. Muy útil en estudios de asociación de macromoléculas y en la detección de los cambios conformacionales que repercutan en las propiedades hidrodinámicas de una molécula.

A disposición de usuarios expertos en la técnica.

14. Robot configurado para la preparación de PCR y purificación de ADN

Descripción: modelo MICROLAB STAR de Hamilton ( foto ). Dispone de 8 canales de pipeteo independientes, y de los siguientes accesorios completamente integrados: estación de lavado activo de puntas, unidad de vacío y lector de absorbancia para placas de 96 o 348 pocillos.

Aplicaciones: manipulación y pipeteo automáticos de líquidos, que lo convierten en una herramienta muy valiosa en la ejecución de distintos métodos de biología molecular, bioquímica e incluso diagnóstico clínico. En particular, se ha configurado para facilitar el trabajo rutinario de preparación de las muestras de ADN para secuenciación; esto es, la PCR y la purificación del ADN previas a colocar las muestras en los analizadores genéticos.

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